重組蛋白是運(yùn)用基因重組技術(shù)，獲得的具有一定功能和活性的蛋白質(zhì)。隨著生物藥物開發(fā)、重組蛋白表達(dá)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域，低成本、短周期、高純度活性蛋白的需求量也與日俱增。相比于天然蛋白，重組蛋白更適用于科學(xué)研究領(lǐng)域，是生物藥、細(xì)胞免疫治療及IVD試劑研發(fā)生產(chǎn)中不可或缺的關(guān)鍵生物試劑。

四大蛋白表達(dá)系統(tǒng)

• 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)（E. coli Expression System）在基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早，是目前應(yīng)用最廣泛的原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌是表達(dá)小分子細(xì)胞質(zhì)蛋白或結(jié)構(gòu)域的首選宿主，具有遺傳背景清楚，生產(chǎn)時(shí)間短，成本低，易于放大生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。
• 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)（Pichia Pastoris Expression System）是一種最經(jīng)濟(jì)高效的真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，可以對多數(shù)蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，能夠制備非常接近于天然蛋白的蛋白原料。
• 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（Baculovirus Expression Vector System）是科研和工業(yè)常用的真核表達(dá)系統(tǒng)之一，可以容納較大的外源片段插入，并且通過該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白，具有完整的生物學(xué)功能。
• 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（Mammalian Cell Expression System）表達(dá)的重組蛋白，天然結(jié)構(gòu)完整，生物活性接近于天然蛋白質(zhì)，因此在生物制藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

蛋白純化策略

為了研究某一個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，首先應(yīng)該將目標(biāo)蛋白質(zhì)從細(xì)胞裂解液的全部組分中分離出來，同時(shí)需要保留目標(biāo)蛋白的生物學(xué)活性及化學(xué)完整性。不同蛋白質(zhì)的氨基酸序列及空間結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致其在物理、化學(xué)、生物學(xué)等性質(zhì)上存在差異，利用待分離蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)性質(zhì)上的差異，即可以設(shè)計(jì)出一套合理的蛋白純化方案。

蛋白純化方法

純化蛋白的方法主要可以分為三類：沉淀、離心和層析。

• 鹽析沉淀是在蛋白質(zhì)水溶液中加入中性鹽，隨著鹽濃度增大而使蛋白質(zhì)沉淀出來的方法。等電點(diǎn)沉淀是利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低而不同蛋白質(zhì)又具有不同等電點(diǎn)的特點(diǎn)進(jìn)行分離的方法。有機(jī)溶劑沉淀是利用與水互溶的有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低而沉淀的方法。
• 速率區(qū)帶離心是根據(jù)顆粒在介質(zhì)中的沉降速度不同來分離試樣的方法。差速離心是逐漸提高離心速度來分離不同大小的細(xì)胞器的方法。
• 疏水相互影響層析是利用蛋白質(zhì)表面的疏水部位和固定相上的疏水基團(tuán)的結(jié)合來分離不同蛋白質(zhì)的方法。凝膠層析是利用混合物隨流動性相流過配有凝膠固定不動相的層析柱時(shí)速度不一致而分離的方法。上述方法由于存在特異性低、純化蛋白純度不高和活性低等缺點(diǎn)，在實(shí)際生產(chǎn)中用的頻次比較低。應(yīng)用較多的純化方法是層析法中的親和層析和離子交換層析。

親和層析是利用固定相的結(jié)合特性來分離不同分子的方法。當(dāng)含有被分離物質(zhì)的混合物隨著流動相流經(jīng)層析柱時(shí)，親和吸附劑上的配基就有選擇地吸附能與其結(jié)合的物質(zhì)，而其他的蛋白質(zhì)及雜質(zhì)未被吸附，從層析柱中流出。

離子交換層析是一種以離子交換樹脂或化學(xué)鍵合離子交換劑為固定相，利用被分離組分離子交換能力的差別或選擇性系數(shù)的差別而實(shí)現(xiàn)分離的方法。當(dāng)一定量的溶液通過交換柱時(shí)，由于溶液中的離子不斷被交換而濃度逐漸減少，因此也可以全部被交換而吸附在交換劑上。融合的蛋白質(zhì)能夠根據(jù)逐漸提升過柱液中的含鹽量或者提升過柱液的pH值過柱出來。

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參考文獻(xiàn)：

Labrou NE. Protein purification: an overview. Methods Mol Biol. 2014;1129:3-10. doi: 10.1007/978-1-62703-977-2_1.